ROJECT 197 PED

REZUMAT ETAPA I

Project title: Functional electromagnetic active scaffolds for bone regeneration / Scafolduri funcţionale active din punct de vedere electromagnetic pentru regenerare osoasă

Acronim: EMABON

 

Identifiers:

CONTRACTUL DE FINANTARE NR. 197PED din 17/08/2017

Cod depunere: PN-III-P2-2.1-PED-2016-1787

 

Consortium:

Coordonator (CO) - INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE DEZVOLTARE PENTRU FIZICA LASERILOR, PLASMEI SI RADIATIEI - INFLPR RA

Partener (P1) - INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE - DEZVOLTARE PENTRU FIZICA SI INGINERIE NUCLEARA " HORIA HULUBEI " - IFIN - HH

 

About project

 

Abstract

We have recently obtained in vitro results related to 3D biomimetic, electromagnetic active scaffolds for bone regeneration and we want to validate them in vivo, in terms of osseointegration and osteogenic potential. Our motivation relies on the fact that, although our preliminary in vitro tests were encouraging, a realistic estimation of scaffolds ability to promote the bone growth requires a translational in vivo testing model. In this context, EMABON project will develop functional 3D biomimetic, electromagnetic active scaffolds with strong osseointegration and osteogenic potential. The scaffolds will be validated in vivo, by implantation at the site of femoral defects artificially created in skeletally mature rats. The osteogenesis will be promoted via the synergic action of scaffolds biomimetic architecture and remotely applied electromagentic stimuli. Through the proposed methodology and expected results, EMABON reponds to a major issue of public health related to poor bone quality and bone-loss associated conditions such as osteoporosis, diabetes mellitus or chronic kidney disease. The proposed model will also find usefulness for orthopedic surgery goals, such as fracture repair, arthroplasty or plate and screw fixation.

 

Aim

The goal of EMABON project is to validate in vivo an existing experimental demonstrative model that we recently tested in vitro. The experimental demonstrator is represented by 3D biomimetic, electromagnetic active scaffolds for bone regeneration. The end result will consist in scaffolds with better osseointegration and superior osteogenic potential than the existing bone grafts. The project will:

 

Specific objectives:

O1. To develop an in vivo model for assessment of functional 3D biomimetic, electromagnetic active scaffolds for bone regeneration.

O2. To validate the scaffolds in vivo, on animal models.

O3. To surpass the performances of existing scaffolds for bone regeneration.

 

Budget

Phase No.

Name

Period

Budget (LEI)

1

Proiectareaprocedurilorexperimentale in vivo / Design of in vivo experimental procedures

17/08/2017 - 31/12/2017

176.470,00

2

Validarea in vivo a scafoldurilor active din punct de vedere electromagnetic / In vivo validation of the electromagnetic active scaffolds

01/01/2018 - 31/12/2018

298.530,00

TOTAL

475.000,00

 

Personnel list

No. crt.

Name

Institution

Profession

Position

1

Luculescu Catalin Romeo

INFLPR

Senior researcher II

Project manager

2

Paun Irina Alexandra

INFLPR

Senior researcher II

Key person

3

Sporea Dan

INFLPR

Senior researcher I

Member

4

Popescu Andrei

INFLPR

Senior researcher II

Member

5

Calin Bogdan Stefanita

INFLPR

Junior researcher

Member

6

PorosnicuCorneliu Constantin

INFLPR

Senior researcher III

Member

7

Stochioiu Andrei

INFLPR

Junior researcher

Member

8

Acasandrei Adriana Maria

IFIN-HH

Senior researcher III

Partner responsible

9

Mustaciousu Cosmin Catalin

IFIN-HH

Junior researcher/Veterinary surgeon

Key person

10

Popescu Roxana Cristina

IFIN-HH

Junior researcher

Member

11

TemelieMihaela

IFIN-HH

Junior researcher

Member

12

Savu Iulia Diana

IFIN-HH

Senior researcher III

Member

13

Polifron Victoria

IFIN-HH

Technician

Member

 

 

Rezultate Etapa I

Etapa I a proiectului are ca obiectiv proiectarea procedurilor experimentale in vivo.

Pentru atingerea acestui obiectiv, am planificat si realizat urmatoarele ativitati:

 

Activitatea 1.1 Proiectarea modelului animal

Modelul animal se realizeaza intr-o biobaza autorizata conform ordinului Ordinul nr. 97/2015 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind procedura de autorizare sanitară veterinară a unităţilor utilizatoare, crescătoare şi furnizoare de animale utilizate în scopuri ştiinţifice, pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind procedura de autorizare sanitară veterinară a proiectelor care implică utilizarea animalelor în proceduri, precum şi pentru modificarea Normei sanitare veterinare privind procedura de înregistrare/autorizare sanitar-veterinară a unităţilor/centrelor de colectare/exploataţiilor de origine şi a mijloacelor de transport din domeniul sănătăţii şi al bunăstării animalelor, a unităţilor implicate în depozitarea şi neutralizarea subproduselor de origine animală care nu sunt destinate consumului uman şi a produselor procesate, aprobată prin Ordinul preşedintelui Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor nr. 16/2010, de catre DSV Ilfov.

Documente de referinta:

SR EN ISO/10993-6:2016- Test for local effects after implantation

ASTM F543 - 17 Standard Specification and Test Methods for Metallic Medical Bone Screws

ASTM F382 - 14 Standard Specification and Test Method for Metallic Bone Plates

ISO 10993-1:2009 Bilological evaluation of medical devices - Part1: Evaluation and testing within a risk management system

ISO 10993-2:2006 Biological evaluation of medical devices - Part 2: Animal welfare requirements

ISO/TS 22911:2005 Dentistry - Preclinical evaluation of dental implant systems - Animal test methods

ISO 7405:2008 Dentistry - Evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry

Intreaga parte in vivo a acestui proiect se realizeaza sub directa supraveghere si participare a medicului veterinar desemnat posesor al atestatului de libera practica veterinara seria A nr. 010520 eliberat in 31.07.2006.

Se vor folosi sobolani Wistar adulti (peste 150g) cu acte de provenienta si certificat de sanatate. Acestia vor fi mentinuti in custi speciale cu talaj care va fi schimbat la maxim 3 zile.

Sobolanii vor fi hraniti cu nutret combinat granulat special si li se administra apa ad libitum pe toata perioada experimentului, mai putin cu o noapte inainte de procedura chirurgicala cand vor fi private de hrana pentru a nu diminua efectele anesteziei. Microclimatul in custi va fi cel recomandat de furnizor in sensul asigurarii unei temperaturi de 18-240C, umiditate relativa de 45-65% si un ciclu de lumina/intuneric de 12h/12h cu iluminare partial artificiala partial naturala. Dupa perioada de acomodare (de minim 5 zile) se verifica prin inspectie starea de sanatate a animalelor.

Pentru evaluare se va compara zonele implantate de la indivizii ale caror implanturi au fost stimulate magnetic cu cele fara stimulare magnetica.

Asa cum specifica standardul ISO-10993-6, studiile pe sobolani nu vor depasi 52 saptamani. Greutatea corporala se evalueaza pe timpul testului si se inregistreaza, aceasta fiind unul dintre criteriile de evaluare.


 

Activitatea 1.2 Proiectarea arhitecturii scafoldurilor active din punct de vedere electromagnetic

O limitare majoră a structurilor de tip scaffold pentru ingineria țesutului osos este aceea că majoritatea celulelor se atașează rapid pe marginile exterioare ale structurii, restricționând penetrarea celulelor în părțile interioare și provocând formarea unui miez necrotic. Mai mult, aceste structuri dispun în general de un aranjament spațial aleator și nu păstrează izotropia pe întregul volum. In cadrul Etapei I a proiectului, am proiectat structuri de tip scaffold inovatoare, cu o arhitectura de tip fagure (care vor fi denumite in continuare HS), cu arhitectură reproductibilă și izotropă, care sa permita migrarea osteoblastelor "în volum". Structurile au fost realizate din microtuburi verticale aranjate într-o configurație cu mai multe straturi, prin tehnica scrierii directe cu laser prin polimerizarea cu doi fotoni (LDW via TPP) in fotopolimerul IP-L780.

Folosind Limbajul General de scriere (GWL) produs de Nanoscribe, am proiectat o structură inovatoare, în formă de fagure, bazată pe microtuburi verticale într-o configurație multistrat. Microtuburile care formează straturile impare diferă de cele din straturile pare în ceea ce privește diametrul și înălțimea. Microtuburile care formează straturile impare au avut diametre D1 = 25 µm, aproape de dimensiunea medie a celulelor MG-63. Înălțimile lor H1 au variat între 2 și 20 μm, pentru a crea spații diferite între straturi. Microtuburile din straturile pare au avut diametre D2 = 10 µm și înălțimi (H2) între 2 și 20 µm.


 

Activitatea 1.3 Proiectarea configuratiei electromagnetice

In vederea stimulari electromagnetice a scaffoldurilor, activitate prevazuta in etapa II a proiectului), in cadrul Etapei I a fost proiectata si realizata o bobina. Parametri fizici și geometrici au fost proiectati cu COMSOL Multiphysics®. În figura 2 se pot observa valori ale inducției câmpului magnetic de pana la maxim 0.7 T.

După efectuarea calculelor, s-a trecut la realizarea bobinei, ținând cont de limitările spatiale impuse de experimentele in vivo care urmeaza a fi desfasurate in Etapa II. Dimensiunile bobinei:

Diametrul interior = 10 mm

Diametrul exterior = 50 mm

Înălțimea = 38 mm

Numărul de spire = 330

Fir de cupru cu diametrul = 1 mm

Rezistivitatea cuprului = 1,7*10-8 Ω*m

Au fost realizate măsurători efective ale inducției magnetice ale bobinei. Măsurătorile au fost făcute cu un teslametru care dispune de o sondă perpendiculară la diferite distanțe de marginea exterioară a bobinei.


 

Activitatea 1.4 Fabricarea scafoldurilor active din punct de vedere electromagnetic

Structurile au fost fabricate prin scriere directă cu laser prin polimerizare cu doi fotoni (LDW by TPP), utilizând sistemul Photonic Professional 3D Nanoscribe GmbH. Am folosit un fotopolimer disponibil comercial, IP-L780 (Nanoscribe GmbH), o formula lichidă biocompatibilă, optimizată pentru structurarea rapidă 3D. Fotopolimerul a fost depus pe lemele de sticla polimerizat prin iradiere cu impulsuri laser focalizate care la rata de repetitie de 80 MHz, durata impulsului de 120 fs și lungimea de undă centrat la 780 nm. Diametrele microtuburilor pentru straturile impare si pare fost setate la 25 și, respectiv, 10 μm. Înălțimile microtuburilor au variat între 2 și 20 μm pentru straturile impare și, respectiv, pare. Scanarea 3D a probei a fost efectuată prin sisteme piezoelecrice iar poziționarea grosieră a fost efectuată prin sisteme motorizate XY. Fiecare structură a fost produsă pe o suprafață de 520 × 520 µm2 . În urma iradierii laser, regiunile neexpuse ale foopolimerului s-au dizolvat prin imersarea probelor în Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate (PGMEA). Probele au fost apoi spălate cu alcool izopropilic și lăsate să se usuce în aer, la temperatura camerei.

Structurile au fost investigate prin microscopie electronică cu baleiaj (SEM, model FEI InspectS). Înainte de examinarea SEM, probele au fost acoperite cu un strat de aur de grosime aproximativ 10 nm. Structurile au fost de asemenea proiectate în Solid Works pentru a le calcula volumul, suprafața și porozitatea. Pentru a simplifica, structurile 3D vor fi denumite în continuare ca funcție de înălțimile și diametrele microtuburilor.

Structura proiectată pe calculator a fost imprimată în fotopolimerul IP-L780. Grosimea pereților microtuburilor a fost de aproximativ 915 nm, măsurată in imaginile SEM. Deoarece mărimea voxelului are o formă elipsoidală de lățime aproximativă de 1 μm și înălțime de 4 μm, microtuburile din straturile pare au fost interconectate unele cu altele de-a lungul axei verticale.


 

Activitatea 1.4 Diseminare-Raport de faza

Procedurile si rezultatele obtinute in cadrul Etapei I au fost diseminate in Raportului Stiintific anual.

Concluzii:

Obiectivul propus in cadrul Etapei a proiectului a fost atins si au fost realizate toate activitatile prevazute in planul de activitati, dupa cum urmeaza:

A fost proiectat modelul animal care urmeaza a fi utilizat pentru testele in vivo prevazute in Etapa II a proiectului.

A fost proiectata arhitectura scaffoldurilor active din punct de vedere electromagnetic. Mai precis, a fost proiectata o structură 3D inovativa, în formă de fagure, bazată pe microtuburi verticale aranjate într-o configurație multistrat. Structura în ansamblu a fost conceputa pentru a promova atașarea și creșterea celulelor de tip osteoblast într-o configurație 3D similară structurii osoase întâlnite in vivo, pentru a facilita interconexiunile celulare, pentru a asigura accesul nervilor până la nivelul celular și pentru a sprijini metabolismul celular prin vascularizarea și transportul nutrienților către celule.

A fost proiectata o configuratie de tip solenoid, in vederea stimuarii electromagnetice in vivo a scaffoldurilor, care urmeaza a fi desfasurata in Etapa II.

Au fost fabricarte scaffoldurile sub forma de structuri 3D prin tehnica scrierii directe laser prin polimerizare cu 2 fotoni (LDW via TPP). Structurile au avut porozități între 86% și 92%, iar microtuburile din straturile impare si pare au asigurat o distribuție biodala a porilor, avand diametre de 25 și respectiv 10 μm. Aceste caracteristici geometrice prezinta un potențial real de susținere a creșterii osoase. Datorită metodei de fabricare, structurile oferă avantajul unor arhitecturi bine definite, controlabile si perfect productibile. Structurilor le-au fost conferite proprietati magnetice prin acoperire cu un amestec de colagen/chitosan/nanoparticule magnetice.

Rezultatele experimentale au fost diseminate in cadrul Raportului Stiintific anual.