RESULTS:

Avantajele tehnologiei Lab-on-chip (LOC) includ miniaturizarea, automatizarea, posibilitatea de a efectua experimente în paralel, costuri reduse, sensibilitate mare, portabilitatea și viteză mare de diagnostic in industria medicala.

Cu acest proiect, noi am realizat biocipuri microfluidice LOC cu geometrii complexe constând din microrezervoare deschise interconectate prin canale fabricate in volumul unor sticle fotosensibile pentru doua aplicații specifice ce urmaresc studiul mecanismelor de metastazare ale celulelor canceroase și, respectiv, propunerea unui model de tipul bariera hematoencefalică pentru boala Alzheimer. Pentru realizarea unor dispozitive relevante studiilor noastre, am realizat montaje de procesare laser cu optică motorizată pentru fabricarea de structuri polimerice în microcanale de sticlă prin polimerizare laser în gradient. Aceste montaje experimentale oferă o soluție de a controla în timp real dimensiunile structurilor realizate în materiale fotosensibile prin iradiere laser cât și pentru aplicații în microscopia optică, folosind optică motorizată. In acelasi timp, am realizat un montaj de analiză celulară in sisteme microfluidice cu sistem dual de imagistică și microfluidică pentru testarea culturilor celulare vii in dispozitivele fabricate.

2021. Prima etapa a acoperit activitățile de procesare laser și caracterizare a dispozitivelor lab-on-a-chip din sticlă și polimeri și analizele in vitro preliminare privind biocompatibilitatea materialelor utilizate. Astfel, am realizat biocipuri microfluidice cu geometrii complexe constând din microrezervoare deschise interconectate prin canale fabricate in volumul unor sticle fotosensibile pentru doua aplicații specifice ce urmaresc studiul mecanismelor de metastazare ale celulelor canceroase și, respectiv, propunerea unui model de tipul bariera hematoencefalic ă pentru boala Alzheimer. Pentru fabricare, am utilizat o tehnologie dezvoltată și validată de noi in laborator ce are la bază protocolul PLAE (picosecond laser assisted etching). Studiile in vitro au confirmat ca suprafețele procesate cu laser prezintă proprietați biocompatibile. Am realizat apoi prin fotopolimerizare cu doi fotoni nanocanale inguste 3D ce conecteaza rezervoare deschise pentru generarea de gradienți de difuzie stabili și apoi am studiat migrarea celulelor de melanom utilizand microscopie de fluorescență time-lapse. Prin microscopie de fluorescență am evidențiat capacitatea materialelor de a oferi celulelor un mediu propice astfel încât acestea să se comporte natural, sa nu își modifice morfologia și să iși păstreze integritatea citoscheletului. Toate aceste aspecte au fost observate la diferite intervale de timp, astfel încât celulele să poată fi analizate din momentul în care încep să se extindă pe suprafețe (după adeziune) până la momente ale primelor diviziuni celulare.

Am realizat un montaj de analiză celulară in sisteme microfluidice cu sistem dual de imagistică și microfluidică. Pentru aceasta, am achiziționat sistemul CellASIC ONIX 2 Microfluidic Platform și cuplat la microscopul Olympus alaturi de componenetele conexe pentru controlul și monitorizarea experimentelor.

2022. In etapa II, am realizat montaje de procesare laser cu optică motorizată pentru fabricarea de structuri polimerice în microcanale de sticlă prin polimerizare laser în gradient. În acest scop, au fost proiectate o serie de scheme pentru analiza în detaliu a parametrilor specifici ai fasciculului laser și pentru a determina configurația optima a setup-ului optic. Conform calculelor numerice, a fost realizat montajul experimental de procesare laser cu control asupra zonei focale în vederea eficientizării procesului de polimerizare utilizând pulsuri laser ultrascurte. Rezultatele obținute în urma iradierii laser în condiții experimentale optime releva rolul pe care îl are variația fina puterii laser și a diametrul spotului fascicului incident asupra dimensiunilor structurilor imprimate în volumul materialelor fotosensibile. Aceste rezultate experimentale oferă o soluție de a controla în timp real dimensiunile structurilor realizate în materiale fotosensibile prin iradiere laser cât și pentru aplicații în microscopia optică, folosind optică motorizată.

Am continuat producerea de biocipuri microfluidice cu geometrii complexe constând din microrezervoare deschise interconectate prin canale fabricate în volumul unor sticle fotosensibile pentru aplicații ce urmaresc studiul mecanismelor de metastazare ale celulelor canceroase. Pentru fabricare, am utilizat tehnologia PLAE (picosecond laser assisted etching), urmată de fotopolimerizare cu doi fotoni pentru a obtine structuri de tip țesut artificial 3D înglobat în microcanal de sticlă pentru generarea de gradienți de difuzie stabili și, respectiv, studiul invazivitatiții celulelor de melanom utilizand microscopie de fluorescență 3D.

Pentru a continua cercetarile în vederea mimării patologiilor de tip neurodegenerativ, am realizat optimizarea protocoalelor de evaluare a barierei hematoencefalice (BHE) pe suporți de sticlă, un prim pas pentru a continua demonstrarea conceptului BHE-on-cip. Astfel, testând diverse medii celulare și chimicale de fixare a celulelor dar și acoperiri de functionalizare, am reusit identificarea unui protocol optim de evidentiere a proteinelor de jonctiune ale BHE.

2023. In aceasta etapa, am utilizat montajele de procesare laser cu optică motorizată pentru fabricarea de structuri polimerice prin polimerizare laser (two photon polimerization TPP). TPP aplicat fotorezistului negativ SU-8 a fost întrebuințat pentru fabricarea de structuri polimerice 3D de tip woodpile pentru investigații celulare canceroase in model lab-on-chip. În mod particular, scaffold-uri cu pori de 0,66 ± 0,15 μm au fost realizate cu succes pentru a fi utilizate drept platforme pentru testarea invazivității celulare. Scaffold-urile au demonstrat capacitatea de a fi utilizate pentru teste de invazivitate atât a liniei celulare sănătoase de tip melanocite cât și a liniei canceroase de melanom. Testele in vitro au sugerat un caracter de invazivitate sporit în cazul co-culturii melanom-melanocite în spații înguste comparativ cu celulele sănătoase, iar efectul inhibitor asupra invaziei melanocitelor a fost atribuit celulelor de melanom prezente în co-cultură.

Am continuat producerea de biocipuri microfluidice cu geometrii complexe constând din microrezervoare deschise interconectate prin canale fabricate în volumul unor sticle fotosensibile pentru aplicații ce urmaresc studiul mecanismelor de metastazare a celulelor canceroase. In aceasta etapă au fost fabricate dispozitive LOC 3D ierarhice (tip cancer-on-chip) din sticlă ce cuprind caracteristici modificabile conform parametrilor de procesare. A fost posibil controlul atât a lungimii cât și a lățimii canalelor, precum și forma și curbura suprafeței pilonilor interiori de sticlă folosiți ca barieră în studii de migrare celulară în spații înguste. S-a observat astfel o dependență între curbura pilonilor și migrarea mai rapidă a celulelor canceroase de prostata (PC3) către intrarea în nanocanale în timpul testelor întreprinse în mediu lipsit de chemoatractant.

În vederea monitorizării motilității celulelor canceroase, au fost întreprinse vizualizări de tip time lapse pe perioade îndelungate, de aproximativ 2 -3 zile, pentru a corela pe viitor motilitatea celulară pe spații libere cu invazivitatea în spații constrictive. În urma analizei folosind programul ImageJ și un script în limbajul Python, au fost extrase ariile de motilitate ale celulelor și calculate vitezele de deplasare. Am evidentiat o influență substanțială a unui coating cu colagen asupra motilitatii celulelor canceroase.

Am dezvoltat un protocol de evaluare a BHE pe cip de sticlă, si am demonstrat un concept BHE-on-cip. In urma rezultatelor obtinute putem spune ca protocoalele optimizate pot fi folosite in vederea investigarii BHE in conditii fiziologice si patologice.

 

Publications:
[1] F. Sima, K. Sugioka, “Ultrafast laser manufacturing of nanofluidic systems”, Nanophotonics 10 (9), 2389, 2021.
[2] C.E. Staicu, F. Jipa, E. Axente, M. Radu, B.M. Radu, F. Sima, “Lab-on-a-Chip Platforms as Tools for Drug Screening in Neuropathologies Associated with Blood–Brain Barrier Alterations”, Biomolecules, 11 (6), 916, 2021.

[3] L. Ionel, F. Jipa, A. Bran, E. Axente, Gianina Popescu-Pelin, K. Sugioka, F. Sima, Effect of varied beam diameter of picosecond laser on Foturan glass volume microprocessing, Opt. Express 32(11), 20109 (2024).
[4] F. Jipa, L. Ionel, A. Bran, E. Axente, K. Sugioka, F. Sima, Efficient fabrication of 3D structures in transparent media through the manipulation of optical aberrations, to be submitted, 2023.
[5] S. Orobeti, L. E. Sima, I. Porosnicu, C. Diplasu, G. Giubega, G. Cojocaru, R. Ungureanu, C. Dobrea, M. Serbanescu, A. Mihalcea, E. Stancu, C.E. Staicu, F. Jipa, A. Bran, E. Axente, S. Sandel, M. Zamfirescu, I. Tiseanu, F. Sima, First in vitro experiments using laser-induced very high energy electron FLASH irradiation – potential for anti-cancer therapeutic strategies Scientific Reports 14 (1), 14866, 2024.
[6] L. Ionel, Characterising Spatio-Temporal Coupling of Tightly Focused Femtosecond Laser Pulses in Micro-Structured Dispersive Materials. In Photonics, Vol. 11, No. 8, p. 689, 2024.
[7] L. Ionel, Piston error effect on intensity at the interaction of coherently combined femtosecond laser beams with cone targets, University Politehnica of Bucharest Scientific Bulletin – Series A – Applied Mathematics and Physics, 86(1), 179-190, 2024.

 

Proceedings:

[1] A. Bran, S. Orobeti, F. Jipa, E. Axente, L. E. Sima, F. Sima, K. Sugioka, “Woodpile-like SU-8 scaffolds fabricated by two photon polymerization for 3D cancer cell invasion assay”, Proceedings of LPM2023 – the 24th International Symposium on Laser Precision Microfabrication, 1-5, 2023.

[2] F. Sima, M. Hanzawa, K. Obata, H. Kawano, K. Sugioka, “Processing 3D transparent materials with sub-micron precision by ultra-fast laser technologies: application to cancer research”, Proceedings of LPM2023 – the 24th International Symposium on Laser Precision Microfabrication, 1-4, 2023.