CETAL |PCE Projects (PN-III-P4-IDPCE) | PCE_8/2021

        

        

      

        

    

PCE_8/ 2021 Project


English (Engleză)
Project title: Transparent material processing by nanophotonic technologies for Lab-on-Chip applications / nanoLOC

Periode: 04 Ian 2021 - 29 Dec 2023  

Contact Person:
Project Director: Dr. Felix SIMA (INFLPR)

Coordinator:
National Institute for Laser, Plasma and Radiation Physics - I.N.F.L.P.R.
Atomiștilor 409, Măgurele, Romania
 
Project Summary:
With this project we propose new photonic methods for interaction with various transparent materials using picosecond laser pulses in two processing schemes: subtractive and additive processing. Both fundamental aspects of laser-matter interaction as well as development of technological processes for fabricating miniaturized Lab-on-Chip (LOC) devices will be approached. Direct laser writing, followed by wet chemical etching and annealing treatments will be performed to create 3D microfluidic circuits with nano-characteristics inside glass and polymeric materials. We will further characterize cells grown in 3D complex configurations by fluorescence analyses inside LOCs. Finally, we will test our devices with living cells in a 4D environment with a dual microfluidic-imagining station. We will aim LOC applications for both cancer research to study mechanisms of metastasis and Alzheimer disease by developing a blood brain barrier model, respectively. 
 
 

Objectives:
The goal of the project is to produce and test miniaturized 3D lab-on-chip (LOC) microsystems for cancer and blood brain barrier (BBB) applications. The main directions in the project are:
i) laser processing of transparent materials for LOC;
ii) LOC microscopic and spectroscopic analyses;
iii) LOC in vitro testing.

 

 

Estimated results:

1. Microdevices with nanochannels and pores down to 500 nm diameter;
2. Laser setup with motorized optics for dynamic laser-induced gradient polymerization in 3D transparent microsystems;
3. Integrated LOC cell analysis setup using a dual microfluidic-imaging platform;
4. BBB-on-chip proof-of-concept;
5. Cancer-on-chip proof-of-concept;
6. Defence of at least one PhD thesis.

 

Research Team:     
        • Dr. Felix Sima
        • Dr. Emanuel Axente
        • Dr. Florin Jipa
        • Dr. Laura Ionel
        • PhD student Stefana Orobeti (Iosub)
        • PhD student Cristina Staicu
    
Internship:     
        • Master student  Alexandra Bran
    

Română (Romanian)
Titlul proiectului: Tehnologii nanofotonice de procesare a materialelor transparente pentru aplicatii Lab-on-Chip / nanoLOC

Perioada: 04 Ian 2020 - 29 Dec 2023 

Persoana de contact:
Director Proiect: Dr. Felix SIMA (INFLPR)
 
Coordonator:
Institutul Național pentru Fizica Laserilor, Plasmei și Radiației - I.N.F.L.P.R.
Atomiștilor 409, Măgurele, ROMÂNIA
 
Rezumat:
In acest proiect propunem noi metode fotonice de interactie cu diverse materiale transparente folosind pulsuri laser cu durate de ordinul picosecundelor in doua scheme de procesare: substractiva si aditiva. Vor fi abordate atat aspectele fundamentale ale proceselor la interactia laser-materie cat si eventualele dezvoltari tehnologice pentru fabricarea unor dispozitive miniaturale  Lab-on-Chip (LOC). Vor fi efectuate experimente de scriere directa cu laser, corodari chimice umede si tratamente termice pentru a crea circuite microfluidice cu caracteristici nano-dimensionale in sticle si polimeri. Vom efectua apoi analize rapide de fluorescenta 3D a unor celule cultivate in structurile fabricate. In final, vom testa dispozitivele cu culturi celulare vii in mediu 4D cu ajutorul unei statii duale de microfluidica si imagistica. Vom urmari cu prioritate doua aplicatii ale LOC privind studiul mecanismelor de metastazare ale celulelor canceroase si respectiv propunerea unui model de tipul bariera hematoencefalica pentru boala Alzheimer.     

Obiective:
Obiectivul principal al proiectului este realizarea si testarea de microsisteme miniaturale 3D de tipul lab-on-chip (LOC) ca modele de laborator pentru studiul cancerului si, respectiv, al barierei hematoencefalice. Directiile principale ale proiectului sunt:
i) procesarea laser a materialelor transparente pentru realizarea de microsisteme LOC;
ii) analize microscopice si spectroscopice ale microsistemelor LOC;
iii) testarea in vitro a sistemelor LOC.
 
Rezultate estimate:
1. Microdispozitive cu nanocanale si pori de dimensiuni reduse pana la 500 nm;
2. Realizarea unui montaj de procesare laser cu optica motorizata pentru fabricarea de structuri polimerice in LOC prin polimerizare laser in gradient;
3. Realizarea unei platforme integrate de analiza celulara in LOC cu sistem dual de imagistica si microfluidica;
4. Demonstrarea unui concept BBB pe cip;
5. Demonstrarea unui concept cancer pe cip;
6. Finalizarea a minim o teza de doctorat.

Echipa de cercetare:     
    • Dr. Felix Sima
    • Dr. Emanuel Axente
    • Dr. Florin Jipa
    • Dr. Laura Ionel
    • PhD student Stefana Orobeti (Iosub)
    • PhD student Cristina Staicu     

 

Stagiu de practică:     

        • Student masterand  Alexandra Bran

    


RESULTS:

Avantajele tehnologiei Lab-on-chip (LOC) includ miniaturizarea, automatizarea, posibilitatea de a efectua experimente în paralel, costuri reduse, sensibilitate mare, portabilitatea și viteză mare de diagnostic in industria medicala.

Cu acest proiect, noi am realizat biocipuri microfluidice LOC cu geometrii complexe constând din microrezervoare deschise interconectate prin canale fabricate in volumul unor sticle fotosensibile pentru doua aplicații specifice ce urmaresc studiul mecanismelor de metastazare ale celulelor canceroase și, respectiv, propunerea unui model de tipul bariera hematoencefalică pentru boala Alzheimer. Pentru realizarea unor dispozitive relevante studiilor noastre, am realizat montaje de procesare laser cu optică motorizată pentru fabricarea de structuri polimerice în microcanale de sticlă prin polimerizare laser în gradient. Aceste montaje experimentale oferă o soluție de a controla în timp real dimensiunile structurilor realizate în materiale fotosensibile prin iradiere laser cât și pentru aplicații în microscopia optică, folosind optică motorizată. In acelasi timp, am realizat un montaj de analiză celulară in sisteme microfluidice cu sistem dual de imagistică și microfluidică pentru testarea culturilor celulare vii in dispozitivele fabricate.

2021. Prima etapa a acoperit activitățile de procesare laser și caracterizare a dispozitivelor lab-on-a-chip din sticlă și polimeri și analizele in vitro preliminare privind biocompatibilitatea materialelor utilizate. Astfel, am realizat biocipuri microfluidice cu geometrii complexe constând din microrezervoare deschise interconectate prin canale fabricate in volumul unor sticle fotosensibile pentru doua aplicații specifice ce urmaresc studiul mecanismelor de metastazare ale celulelor canceroase și, respectiv, propunerea unui model de tipul bariera hematoencefalic ă pentru boala Alzheimer. Pentru fabricare, am utilizat o tehnologie dezvoltată și validată de noi in laborator ce are la bază protocolul PLAE (picosecond laser assisted etching). Studiile in vitro au confirmat ca suprafețele procesate cu laser prezintă proprietați biocompatibile. Am realizat apoi prin fotopolimerizare cu doi fotoni nanocanale inguste 3D ce conecteaza rezervoare deschise pentru generarea de gradienți de difuzie stabili și apoi am studiat migrarea celulelor de melanom utilizand microscopie de fluorescență time-lapse. Prin microscopie de fluorescență am evidențiat capacitatea materialelor de a oferi celulelor un mediu propice astfel încât acestea să se comporte natural, sa nu își modifice morfologia și să iși păstreze integritatea citoscheletului. Toate aceste aspecte au fost observate la diferite intervale de timp, astfel încât celulele să poată fi analizate din momentul în care încep să se extindă pe suprafețe (după adeziune) până la momente ale primelor diviziuni celulare.

Am realizat un montaj de analiză celulară in sisteme microfluidice cu sistem dual de imagistică și microfluidică. Pentru aceasta, am achiziționat sistemul CellASIC ONIX 2 Microfluidic Platform și cuplat la microscopul Olympus alaturi de componenetele conexe pentru controlul și monitorizarea experimentelor.

2022. In etapa II, am realizat montaje de procesare laser cu optică motorizată pentru fabricarea de structuri polimerice în microcanale de sticlă prin polimerizare laser în gradient. În acest scop, au fost proiectate o serie de scheme pentru analiza în detaliu a parametrilor specifici ai fasciculului laser și pentru a determina configurația optima a setup-ului optic. Conform calculelor numerice, a fost realizat montajul experimental de procesare laser cu control asupra zonei focale în vederea eficientizării procesului de polimerizare utilizând pulsuri laser ultrascurte. Rezultatele obținute în urma iradierii laser în condiții experimentale optime releva rolul pe care îl are variația fina puterii laser și a diametrul spotului fascicului incident asupra dimensiunilor structurilor imprimate în volumul materialelor fotosensibile. Aceste rezultate experimentale oferă o soluție de a controla în timp real dimensiunile structurilor realizate în materiale fotosensibile prin iradiere laser cât și pentru aplicații în microscopia optică, folosind optică motorizată.

Am continuat producerea de biocipuri microfluidice cu geometrii complexe constând din microrezervoare deschise interconectate prin canale fabricate în volumul unor sticle fotosensibile pentru aplicații ce urmaresc studiul mecanismelor de metastazare ale celulelor canceroase. Pentru fabricare, am utilizat tehnologia PLAE (picosecond laser assisted etching), urmată de fotopolimerizare cu doi fotoni pentru a obtine structuri de tip țesut artificial 3D înglobat în microcanal de sticlă pentru generarea de gradienți de difuzie stabili și, respectiv, studiul invazivitatiții celulelor de melanom utilizand microscopie de fluorescență 3D.

Pentru a continua cercetarile în vederea mimării patologiilor de tip neurodegenerativ, am realizat optimizarea protocoalelor de evaluare a barierei hematoencefalice (BHE) pe suporți de sticlă, un prim pas pentru a continua demonstrarea conceptului BHE-on-cip. Astfel, testând diverse medii celulare și chimicale de fixare a celulelor dar și acoperiri de functionalizare, am reusit identificarea unui protocol optim de evidentiere a proteinelor de jonctiune ale BHE.

2023. In aceasta etapa, am utilizat montajele de procesare laser cu optică motorizată pentru fabricarea de structuri polimerice prin polimerizare laser (two photon polimerization TPP). TPP aplicat fotorezistului negativ SU-8 a fost întrebuințat pentru fabricarea de structuri polimerice 3D de tip woodpile pentru investigații celulare canceroase in model lab-on-chip. În mod particular, scaffold-uri cu pori de 0,66 ± 0,15 μm au fost realizate cu succes pentru a fi utilizate drept platforme pentru testarea invazivității celulare. Scaffold-urile au demonstrat capacitatea de a fi utilizate pentru teste de invazivitate atât a liniei celulare sănătoase de tip melanocite cât și a liniei canceroase de melanom. Testele in vitro au sugerat un caracter de invazivitate sporit în cazul co-culturii melanom-melanocite în spații înguste comparativ cu celulele sănătoase, iar efectul inhibitor asupra invaziei melanocitelor a fost atribuit celulelor de melanom prezente în co-cultură.

Am continuat producerea de biocipuri microfluidice cu geometrii complexe constând din microrezervoare deschise interconectate prin canale fabricate în volumul unor sticle fotosensibile pentru aplicații ce urmaresc studiul mecanismelor de metastazare a celulelor canceroase. In aceasta etapă au fost fabricate dispozitive LOC 3D ierarhice (tip cancer-on-chip) din sticlă ce cuprind caracteristici modificabile conform parametrilor de procesare. A fost posibil controlul atât a lungimii cât și a lățimii canalelor, precum și forma și curbura suprafeței pilonilor interiori de sticlă folosiți ca barieră în studii de migrare celulară în spații înguste. S-a observat astfel o dependență între curbura pilonilor și migrarea mai rapidă a celulelor canceroase de prostata (PC3) către intrarea în nanocanale în timpul testelor întreprinse în mediu lipsit de chemoatractant.

În vederea monitorizării motilității celulelor canceroase, au fost întreprinse vizualizări de tip time lapse pe perioade îndelungate, de aproximativ 2 -3 zile, pentru a corela pe viitor motilitatea celulară pe spații libere cu invazivitatea în spații constrictive. În urma analizei folosind programul ImageJ și un script în limbajul Python, au fost extrase ariile de motilitate ale celulelor și calculate vitezele de deplasare. Am evidentiat o influență substanțială a unui coating cu colagen asupra motilitatii celulelor canceroase.

Am dezvoltat un protocol de evaluare a BHE pe cip de sticlă, si am demonstrat un concept BHE-on-cip. In urma rezultatelor obtinute putem spune ca protocoalele optimizate pot fi folosite in vederea investigarii BHE in conditii fiziologice si patologice.

 

Publications:
[1] F. Sima, K. Sugioka, “Ultrafast laser manufacturing of nanofluidic systems”, Nanophotonics 10 (9), 2389, 2021.
[2] C.E. Staicu, F. Jipa, E. Axente, M. Radu, B.M. Radu, F. Sima, “Lab-on-a-Chip Platforms as Tools for Drug Screening in Neuropathologies Associated with Blood–Brain Barrier Alterations”, Biomolecules, 11 (6), 916, 2021.
[3] L. Ionel, F. Jipa, A. Bran, E. Axente, K. Sugioka, F. Sima, Effect of picosecond laser beam expansion on Foturan glass volume micro-processing, to be submitted, 2023.
[4] F. Jipa, L. Ionel, A. Bran, E. Axente, K. Sugioka, F. Sima, Efficient fabrication of 3D structures in transparent media through the manipulation of optical aberrations, to be submitted, 2023.
[5] S. Orobeti, L. E. Sima, I. Porosnicu, C. Diplasu, G. Giubega, G. Cojocaru, R. Ungureanu, C. Dobrea, M. Serbanescu, A. Mihalcea, E. Stancu, C.E. Staicu, F. Jipa, A. Bran, E. Axente, S. Sandel, M. Zamfirescu, I. Tiseanu, F. Sima, First in vitro experiments using laser-induced very high energy electron FLASH irradiation – potential for anti-cancer therapeutic strategies, to be submitted, 2023.
 
Proceedings:

[1] A. Bran, S. Orobeti, F. Jipa, E. Axente, L. E. Sima, F. Sima, K. Sugioka, “Woodpile-like SU-8 scaffolds fabricated by two photon polymerization for 3D cancer cell invasion assay”, Proceedings of LPM2023 – the 24th International Symposium on Laser Precision Microfabrication, 1-5, 2023.

[2] F. Sima, M. Hanzawa, K. Obata, H. Kawano, K. Sugioka, “Processing 3D transparent materials with sub-micron precision by ultra-fast laser technologies: application to cancer research”, Proceedings of LPM2023 – the 24th International Symposium on Laser Precision Microfabrication, 1-4, 2023.

   
Patents:
[1] F. Jipa, C. Butnaru, C.E. Staicu, S. Orobeti (Iosub), E. Axente, F. Sima, “Procedeu de fabricare a unor dispozitive microfluidice tridimensionale in sticla fotosensibila prin procesare substractiva cu fascicul laser cu pulsuri de ordinul picosecondelor”, OSIM, A/00723, November 11, 2022.

 

Conference presentations:
[1] F. Sima, H. Kawano, A. Miyawaki, K. Obata, D. Serien, K.Sugioka, Prostate cancer cells retain their cell division ability upon migration through sub-micrometric intravasation-extravasation-like confining spaces, Oral presentation, RIKEN Workshop on Multi-Dimensional Cell Measurement, Online, 24 February 2021.

[2] F. Sima, K. Sugioka, 3D glass nanofluidics fabricated by femtosecond laser processing for study on cancer cell metastasis, On demand Paper 11637-26, Photonics West, Online, 6-11 March, 2021.

[3] F. Sima, S. Orobeti, C. Butnaru, F. Jipa, E. Axente, H. Kawano, A. Miyawaki, K. Obata, D. Serien, K. Sugioka, Ultrafast Laser Processing of Glass Microfluidic Systems: Application to Cancer Research, Invited presentation, XXVIth International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics of the Bioelectrochemical Society, virtual mode (Cluj-Napoca, Romania), 9-13 May, 2021.

[4] F. Sima, F. Jipa, C. Butnaru, S. Orobeti, E. Axente, H. Kawano, A. Miyawaki, K. Obata, D. Serien, K. Sugioka, “Hybrid laser technologies for biomimetic material processing”, Invited presentation at 2nd International Summit on Optics, Photonics and Laser Technologies (Optics-2021) (virtual), June 28-30, 2021.

[5] C. E. Staicu, F. Jipa, A. Bonciu, E. Axente, B. M. Radu, F. Sima, “Laser processing of lab-on-chip microfluidic platforms for BBB modeling”, 23rd Symposium "Signal Transduction at the Blood-Brain Barriers", (virtual symposium), September 22-24, 2021.

[6] C. E. Staicu, C. Butnaru, F. Jipa, A. Bonciu, C. M. Rusu, E. Axente, B. M. Radu, F. Sima, “Investigation of new polymeric materials and photosensitive glasses for blood brain barrier applications”, oral presentation, “2nd International Conference on Neuroscience, Neuroinformatics, Neurotechnology and Neuro-Psychopharmacology - ICON4N”, (virtual), November 18-20, 2021.

[7] M. A. Bran, F. Jipa, C. E. Staicu, E. Axente, K. Sugioka, F. Sima, “Woodpile Structures Fabricated in Microfluidic Channels by Laser Processing for 3D Cellular Studies”, 1st International Conference on Lasers, Plasma, and Radiation – Science and Technology (ICLPR-ST2022), Hybrid format, Bucharest, Romania & online, (poster presentation), 7 – 10 June, 2022.

[8] C. E. Staicu, F. Jipa, E. Axente, B. M. Radu, F. Sima, “Laser processing manufacture of microfluidic devices for mimicking blood brain barrier”, 1st International Conference on Lasers, Plasma, and Radiation – Science and Technology (ICLPR-ST2022), Hybrid format, Bucharest, Romania & online, (poster presentation), 7 – 10 June, 2022.

[9] C. E. Staicu, F. Jipa, E. Axente, D. D. Banciu, B. M. Radu, F. Sima, “Mimicking blood brain barrier in microfluidic models”, poster presentation, Federation of European Neuroscience Societies (FENS) Forum, Paris, France, 9 – 13 July, 2022.

[10] Florin Jipa, Stefana Orobeti, Cristina Staicu, Emanuel Axente, Hiroyuki Kawano, Koji Sugioka, Felix Sima, “Processing transparent materials with sub-micron precision by ultrafast laser technologies: application to cancer research”, CurvoBio2022 Workshop, Berlin, Germany, (poster presentation), 24-26 August 2022.

[11] A. Bran, S. Orobeti, F. Jipa, E. Axente, L. E. Sima, F. Sima, K. Sugioka, “Woodpile structures fabricated in glass microfluidic channels by laser processing for 3D cellular studies”, 24th International Symposium on Laser Precision Microfabrication, Hirosaki, Aomori, Japan (poster presentation), 13-16 June 2023.

[12] F. Sima, F. Jipa, C. Staicu, A. Bran, E. Axente, H. Kawano, K. Obata, K. Sugioka, “Processing 3D transparent materials by ultra-fast laser technologies: application to cancer research”, 24th International Symposium on Laser Precision Microfabrication, Hirosaki, Aomori, Japan (oral presentation), 13-16 June 2023.

[13] F. Sima, F. Jipa, C. Staicu, S. Orobeti, L. Ionel, A. Bran, E. Axente, K. Sugioka, “Transparent material processing by laser technologies for Lab-on-Chip applications”, International Conference on processing & manufacturing of advanced materials: processing, fabrication, properties, applications (Thermec23), Vienna, Austria (invited presentation), July 2 - 7, 2023.

[14] A. Bran, F. Jipa, S. Orobeti, E. Axente, L. E. Sima, F. Sima, K. Sugioka, “SU-8 Scaffolds Fabricated by Two Photon Polymerization for Cancer Cell Invasion Testing”, 12th International Conference on Photo-Excited Processes and Applications (ICPEPA- 12 – hybrid format), Suzhou, China (online oral presentation), 18-22 September, 2023.

 


AWARDS:

Cristina Staicu - FENS-IBRO/PERC Travel Grant (173 awards of 1767 applications) for the participation at Federation of European Neuroscience Societies (FENS) Forum, presentation title “Mimicking blood brain barrier in microfluidic models”, poster presentation, Paris, France, 9 – 13 July, 2022.

Alexandra Bran, S. Orobeti, F. Jipa, E. Axente, L. E. Sima, F. Sima, K. Sugioka, “Woodpile structures fabricated in glass microfluidic channels by laser processing for 3D cellular studies”, 24th International Symposium on Laser Precision Microfabrication, Hirosaki, Aomori, Japan Best poster presentation – Outstanding Student Paper Award (4 awards of 29 poster student applications), 13-16 June 2023.

Alexandra Bran - SPIE Travel Grant for the participation at Photonics West Conference, oral presentation, San Francisco, SUA, 27 ianuarie – 1 februarie, 2024.


RESEARCH OUTREACH:
Project Open Days: "Cancer-on-chip" experiment prepared and presented live to students and general public during visiting the research institution and lab (Big Brother la microscop: celule canceroase vii observate în nano-acvarii, Saptamana Portilor Deschise la INFLPR, 26-28 septembrie 2022, https://portideschise.inflpr.ro/index.php/experimente/).

INTERNATIONAL COOPERATION:
COST proposal – European Curvature in Biology Network, European project submitted on October 20, 2022 and accepted for financing on May 2023, leading Institution Paris-London University of Salzburg, Austria;     

Professor Koji Sugioka (RIKEN Center for Advanced Laser Photonics, Japan), „Advanced laser processing: 3D micro/nanoprocessing and manipulated laser pulse processing”, INVITED PRESENTATION, CETAL Workshop (https://lpr-st.ro/evenimente/), May 3, 2023;

Laserlab EU project Working groups: Expert Group on Lasers for Cancer Research (https://www.laserlab-europe.eu/expert-groups/laser-for-cancer-research/laser-science-for-cancer-research), Initiation of an European project to be submitted in 2024;

Invited participation to Foresight Workshop on Opportunities with laser-based Technologies 24 & 25 July 2023, Riga, Latvia – Presentation on Microfluidic biochips & high resolution time lapse microscopy: application to cancer research (https://www.laserlab-europe.eu/events-1/laserlab-events/2023/expert-groups_agenda_20230724.pdf).